在现代生命科学领域，蛋白质的一级结构，即其氨基酸序列，已不再被视为静态的分子代码。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性，更深刻地影响了细胞行为、信号传导动态，甚至影响进化路径与疾病机制。因此，获取蛋白质的准确序列成为深入理解其生物学功能与作用机制的基础。

与传统的“蛋白鉴定”不同，蛋白测序（Protein Sequencing）关注的是完整而连续的氨基酸信息，主要用于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白一致性或追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药物开发、个体化医学、结构生物学及抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力愈发成为研究和应用决策的重要技术支撑。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中，“测序”和“鉴定”等术语常被混用，造成术语误用、技术选择失误，甚至影响研究假设的准确性。从定义上讲，蛋白测序是指对蛋白质进行氨基酸序列解析的过程，旨在重建其一级结构的连续排列，通常是从N端到C端表示全部或部分氨基酸序列。其目标是获取“序列本体”，而非仅仅判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。

相比之下，蛋白鉴定（Protein Identification）依赖于质谱与数据库匹配，确定某一肽段是否“属于”某已知蛋白。这是一种分类式的“归属判断”，而非逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演化

1. Edman降解：高精度线性识别的起点

Edman降解方法于20世纪50年代由Pehr Edman首次建立，是蛋白质序列解析的早期化学实现。这一方法基于苯异硫氰酸（PITC）与N端氨基酸的特异性反应，通过顺序性标记与切除，在每一轮循环中释放并鉴定一个PTH-氨基酸，从而实现线性序列重建。尽管它具有单个氨基酸识别的高精度，但应用上存在一些局限性：仅适用于具有游离N端的纯化样品，序列长度通常不超过30-50残基，且无法处理混合物或修饰蛋白。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的核心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展的重要转折点。Bottom-up策略将蛋白质通过特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）酶解为短肽段，随后利用LC-MS/MS对肽段进行碎裂与检测，并通过数据库比对或de novo算法重建蛋白质序列。该策略具备较好的通量和适配性，但仍然面临结构性限制，例如缺乏序列上下文信息以及对高度异构蛋白的适用性不足。

3. Top-down质谱策略：整分子结构识别的深入拓展

Top-down测序策略直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统，跳过酶解步骤，通过高能碎裂解析其多级碎片离子，实现对一级结构的全面解析。这一方法能够在不破坏天然修饰组合的前提下，提供精确的序列及修饰定位信息，尤其适用于蛋白质翻译后修饰（PTM）识别和生物药质量评估等。

4. 单分子蛋白测序的兴起

传统质谱测序方法基于肽段碎裂与谱图重建，但存在局限性，因此近年来，研究者开始发展无需酶解、可直接读取氨基酸顺序的单分子测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技术。这类技术旨在实现对单个分子的逐残基识别，极大地推动了蛋白质研究的前进。

例如，纳米孔测序策略利用生物或固态孔道的亚纳米级分辨能力，对蛋白质或短肽分子进行精确检测。此外，荧光法测序通过对特定氨基酸引入可识别的荧光标记，获得更高的特异性识别能力。虽然蛋白测序受到多种因素的影响，其结果往往不具有唯一性，但可以通过不同技术路径的互补来弥补这些不足。

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