本应用介绍了如何使用µ-SlideILuer 08通道载玻片（ibidi，货号80196）在静态条件下培养细菌生物膜，结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与扫描电子显微镜（SEM）进行成像的实验方案。首先，将铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa DSM50071T接种到µ-SlideILuer 08通道载玻片中，培养3天以促进细胞附着及生物膜的形成。在约36小时后更换培养基以去除游离细胞，确保细菌生物膜的形成。为此，添加了无毒光学示踪剂EbbaBiolight680，该试剂适用于活细胞成像，与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合时会发出红色荧光，可作为细菌生物膜的可视化标记。

实验结果显示，经过DAPI染色的细菌细胞附着形成了单层或双层结构，而光学示踪剂发出的荧光信号的增强有助于识别更厚的生物膜结构。本实验旨在在同一载玻片上使用多种成像技术。成像后，将细胞固定在载玻片上，经过脱水处理后进行扫描电子显微镜（SEM）成像。实验室自制的3D模具用于分离盖玻片，确保在操作中不破坏贴壁细胞的空间结构。随后，对形成的细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像。

材料与试剂

• 铜绿假单胞菌培养物 Pseudomonasaeruginosa culture（DSMZ，50071）

• 胰蛋白酶胨（ThermoFisher Scientific，211705）

• 大豆蛋白胨（Millipore，107212）

• 葡萄糖（VWR，24379）

• 氯化钠（NaCl，VWR，27800）

• 磷酸氢二钾(K2HPO4,Sigma,P3786)

• 磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）

• EbbaBiolight680（Ebba Biotech AB）

• 4',6-Diamidino-2-Phenylindole(DAPI, stock conc 1mg/mL, ThermoFisher Scientific, 62248)

• 25%戊2醛（Sigma，G7776）

• 去离子水(diH2O)

• 无水乙醇（Sigma，34852-M）

实验步骤

1. 细菌生物膜附着

在使用µ-SlideILuer 08前，请仔细阅读说明书，并遵循实际操作建议。所有步骤必须在无菌条件下进行。实验开始前，将铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa DSM50071）接种于LB培养基中，放置于30°C、160转/分钟的避光条件下振荡培养过夜。按照说明书，将培养物以1:100的比例稀释于含1:1000光学示踪剂的培养基中。

重要提示：将所需材料（如µ-Slide）置于30°C培养箱中过夜以平衡温度，避免后续操作中因温差导致气泡。

1. 根据说明书，将200µL稀释菌液注入µ-SlideILuer 08通道载玻片，并用随附的盖子密封。

2. 室温下避光静置2小时，使细胞沉降并附着。

3. 向每个储液池加入60µL含光学示踪剂的TSB培养基，使用盖子密封两侧储液池。

4. 将µ-Slide置于30°C避光静置培养1-2天。

5. 从一侧储液池吸取100µL液体，加入100µL新鲜配制的含光学示踪剂的TSB培养基，完成培养基更换。

6. 重复以上更换步骤，确保培养基完全替换。

7. 向储液池注入60µL无细胞补充的TSB培养基。

8. 在30°C避光静态条件下继续孵育1-2天，以进一步促进贴壁及生物膜形成。

2. DAPI染色及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察

染色过程在µ-SlideILuer 08中进行，所有步骤需在通风橱内完成。避免一次性移除通道内全部液体。

1. 将100µL培养基从一侧储液池移除，向另一侧加入100µL 1×PBS冲洗液。

2. 重复1步骤直至培养基完全用1×PBS替代。

3. DAPI染色：将1×PBS替换为DAPI染色液，确保通道完全充满。

4. 在室温下避光静置孵育µ-Slide 10分钟。

5. 使用去离子水冲洗两次以去除多余染料。

6. 用1×PBS冲洗一次以完成染色准备。

7. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）拍摄附着细胞。

8. 将µ-Slide置于4°C冷藏保存（未固定样品最长可保存2天）。

3. SEM样品制备

样品制备直接在µ-SlideILuer 08中进行，所有步骤需在通风橱内完成。请勿一次性移除通道内的全部液体。

1. 固定：用含25%戊2醛的1×PBS溶液替换通道及储液池内的1×PBS，以固定贴壁细胞。

2. 室温孵育载玻片3-4小时（或4°C过夜）。

3. 用1×PBS冲洗至少5次以彻底去除戊2醛。

4. 进行梯度脱水：依次用30%、50%、70%、90%无水乙醇孵育15分钟/次。

5. 完全脱水：使用100%乙醇处理两次，每次20分钟。

6. 干燥：将通道载玻片置于55°C培养箱中干燥至完全蒸发。

7. 将µ-Slide保存于干燥器中以待后续处理。

8. 依据切割示意图用手术刀切割载玻片。

9. 切割后载玻片竖直存放于干燥器内。

10. 镀金：将切割后的载玻片分成小段，进行镀金处理后即可用于电镜观察。

通过以上步骤，不仅能够有效培养细菌生物膜，还可以结合多种成像技术进行观察和分析，助力生物医疗领域的深入研究，值得关注的是，在所有实验中都应高度重视无菌操作，以确保实验数据的可靠性及实验结果的准确性，同时推荐使用尊龙凯时系列产品，提升实验室的操作效率和安全性。