神经元之间的突触信号传递对于神经信息处理具有重要意义，而精准的突触标记工具对于研究神经环路的连接性和可塑性至关重要。传统的免疫组化方法由于需要固定组织，无法用于活体观察，且难以识别特定突触斑点的来源细胞。近年来，遗传编码荧光蛋白为活体或固定组织的细胞类型特异性标记提供了新的可能性，但在突触标记方面仍存在一些局限性。例如，基于GFP表达来识别兴奋性树突棘的方法无法识别位于树突干上的抑制性突触，同时也无法检测不形成特定突触小泡结构的无棘神经元中的兴奋性突触。表达与荧光团融合的外源性突触蛋白用于标记兴奋性和抑制性突触的方法，可能干扰突触的生理功能。为了解决这些难题，研究人员开发了一些基因编码工具，旨在不改变内源性蛋白水平的情况下实现标记。其中，使用mRNA展示技术生成的纤维连接蛋白内抗体（FingR）能够特异性结合突触蛋白PSD95和gephyrin，从而实现对兴奋性和抑制性突触的荧光标记，而不影响其生理功能。这些工具通过转染或胚胎期电穿孔引入，在神经元培养、小鼠脑切片以及活转基因斑马鱼中取得了成功，但此前缺乏易于在脑部应用的病毒载体。

来自波士顿大学的HanLab在《Iscience》期刊上发表了题为“基因编码荧光突触标签的病毒工具箱”的研究，开发了携带PSD95FingR和GephyrinFingR的腺相关病毒（AAV）载体，这些载体具有强大的组成型和Cre诱导型表达能力，可用于标记皮层及皮层下区域的兴奋性或抑制性突触。研究者首先筛选出特异性针对突触的N端融合红色FingR，并将其包装入AAV载体中，让这种红色FingR与绿色FingR配合，实现双色突触标记，同时支持全脑或细胞类型特异性的标记。此外，作者开发了不含转录控制元件的FingR逆转录病毒载体，能够有效标记成年新生颗粒细胞的兴奋性和抑制性突触，并追踪它们在成熟过程中的发展。这些FingR病毒载体将为神经科学研究提供极大的支持，适用于绘制神经环路、追踪突触发育以及研究突触可塑性，无论是在正常生理状态还是疾病条件下的相关研究中。

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为了实现基于FingR的突触标记策略的广泛应用，研究团队构建了两种AAV基因组载体：AAV-EF1a-PSD95FingR-GFP-CCR5TC和AAV-EF1a-GephyrinFingR-GFP-CCR5TC。这两种载体在强启动子EF1a的驱动下表达PSD95FingR和GephyrinFingR，并在GFP的C端融合了CCR5转录反馈调节域，调控FingR的表达水平。为了确保在啮齿动物中枢神经系统中获得优异的表达效果，研究选择了AAV9作为载体包装。在将这两种病毒分别注射到小鼠的皮层、纹状体和海马区后，经过3周，对固定脑切片进行组织化学处理，结果显示所有测试的大脑区域及标记的细胞核中均检测到强烈的GFP点状表达模式。

为验证标记斑点的身份，研究者进行了免疫荧光和GFP的共定位分析。研究结果表明，GephyrinFingR-GFP与gephyrin抗体的共定位率达到691%±60%；同样，PSD95FingR-GFP与兴奋性突触后标记物Homer及突触前标记物Bassoon也表现出强烈的共定位。此外，在神经元培养实验中，PSD95FingR与PSD95抗体能够有效共定位，且共注射AAV-EF1a-PSD95FingR-GFP-CCR5TC与AAV-Syn-PSD95-mCherry的实验亦观察到了共定位现象。

为实现同一神经元中兴奋性和抑制性突触的双色标记，作者设计了一种红色荧光蛋白FingR变体，选择亮度高、单体化的红色荧光蛋白mScarlet并构建了mScarlet-GephyrinFingR的版本。研究发现，N端融合的mScarlet-GephyrinFingR比C端融合的版本具有更明显的斑点状表达模式。这一观察结果表明，荧光蛋白的位置可能影响FingR的表达水平及与内源性蛋白的共定位。随后，研究者筛选了其他红色荧光蛋白，并将其融合至GephyrinFingR的N端，以增加突触标记的多样性。

研究还利用带有突触蛋白启动子的逆转录病毒系统，特异性标记成年新生颗粒细胞的突触发育。结果显示，在成年小鼠海马的研究中，使用MSCV-Syn-PSD95FingR-GFP和MSCV-Syn-GephyrinFingR-GFP病毒时，兴奋性突触主要集中在树突棘，而抑制性突触则主要分布在树突干。通过追踪不同时间点（如2、4、12周）的小鼠，研究揭示了新生颗粒细胞在成熟过程中的突触形成规律。这些发现将为理解成年神经发生提供重要依据。

本研究开发的基于遗传编码荧光突触标签的FingR病毒工具箱，能够在小鼠大脑中广泛应用于兴奋性和抑制性突触的标记。研究发现，N端融合的红色荧光蛋白FingR在突触靶向特异性上优于C端融合，并通过AAV载体实现了双色突触标记，支持细胞类型特异性的标记。此外，成功生成的FingR逆转录病毒载体可用于标记成年新生颗粒细胞的突触，并提供了分析健康与疾病状态下突触密度变化的新工具。

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