一、细胞培养条件

冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）

传代方法：初次建议1:2传代，每两天更换培养液。
附注：请使用无菌离心管收集培养基，以便进行对比培养。如果对比效果不理想，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

在细胞健康状态下，将其灌满完全培养液并密封瓶口是运输细胞的最佳方式。收到细胞时，需用75%酒精消毒整个细胞瓶，随后放置于超净台内进行无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定后方可进行后续操作。建议使用显微镜观察细胞生长状态，并拍摄不同倍数的照片（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片将作为售后服务的重要依据，若未提供照片则默认细胞状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，需将完全培养液收集至离心管，保留约5ml，放入37℃、5% CO2孵箱培养。如果细胞密度超过80%，请按照以下步骤进行传代：
1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞是否已脱落，若细胞大部分变圆并脱落时，立即轻敲培养瓶，加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打以使细胞完全脱落，然后吸出悬液，转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），每瓶补充5-8ml新的完全培养基，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%的面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 向培养瓶中添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻倾斜观察，待细胞变圆后加入5ml完全培养液以终止消化。再轻轻吹打细胞使其脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存。如需将细胞转移至液氮罐中，请先在-80℃冰箱中存放24小时再进行转移。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（请佩戴防护面具），快速放入37℃水浴解冻，直到冻存管内无结晶后，擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，并接种至T25培养瓶，放置在37℃、5% CO2的培养箱中。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，一些细胞可能会因贴壁不牢而脱落，这是正常现象。若脱落较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，并收集上清用于后续对比培养。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，消化1-2分钟后继续用5ml完全培养基终止反应。再次离心后弃去上清，重新用1-2ml完全培养基重悬，按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最终放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

五、售后条款

1）关于细胞出现问题可重发的情况及判定标准：
1. 由于运输过程中造成的细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等问题，提供重发服务。
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 对于常温发货的细胞，静置24小时后如果干冰冻存发货的细胞在复苏24小时内存活率低于标准（需提交真实清晰的细胞状态照片）同样可重发。
4. 发生污染的情况，需在细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞在静置4小时未开封的情况下，提供重发服务。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内以台盼蓝染色法鉴定后，由技术人员判定。若经验证为我方责任，将进行重发。
6. 为保障售后服务，收到细胞当天及接下来的2、3天内请务必拍照记录，若3天未反馈将视为产品合格。
4-7天内若出现问题，需提供前3天及出现问题时的照片，技术人员将进行责任判定。
尊龙凯时将竭诚为您服务。

2）细胞出现问题后不予重发的情况：
1. 客户操作引起的细胞污染。
2. 不当操作导致细胞状态不佳。
3. 使用非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良。
4. 细胞状态不佳且未提供培养前3天的照片。
5. 处理过的细胞在培养过程中未告知。
6. 收到细胞后两天内未告知出现问题。
7. 其他情况依具体情况而定。